PCR實驗室最容易忽視的環節，老師都沒教過的輔料質檢

今天我們探討的是PCR實驗室最容易忽視的環節，對試驗輔料進行質檢。PCR實驗室的輔料指的是PCR實驗中常用的一些輔助試劑和耗材，比如採樣管、拭子、離心管、PCR管、吸頭、移液器、無核酸酶水和試管架等。

一.輔料質檢的基本原則

輔料的質檢通常是在新一批的輔料到實驗室後統一做一次或者定期（半年或1年）做，因此質檢就包含了驗貨和質檢2個部分。由於輔料的質檢沒有一個統一的標準，一般由各實驗室自行制定，可簡可繁，這裡提出一些方法供大家參考和批評指正。

1.外包裝檢查：外包裝應完整無損無污，標識清楚，檢查品名、品牌，貨號，規格、生產日期，有效期、保存條件等信息。

2.內包裝檢查：內包裝物品應與外包裝標識一致，檢查是否有破損，泄漏，內容物是否齊全，是否有相應的使用說明書等。

3.性能質檢：檢測試劑耗材是否與其性能一致，比如吸頭的準確性和氣密性等

4.污染物質檢：檢測試劑耗材是否被常規檢測項目的待檢物污染，這種污染可能是物品生產環節，也可能是運輸或實驗室的保存過程中被污染。

5.抑制物質檢：檢測試劑耗材中是否存在PCR反應的抑制物，比如核酸酶。

二.輔料質檢的前提條件

1.弱陽性質控：需要準備弱陽性質控，包括標準物質、第三方質控或弱陽性樣品用於進行性能質控和抑制物質控。

2.陰性質控：需要準備確定陰性的樣品或空白對照，用於進行污染物的質控。

3.重複次數n：中國人喜歡3(三顧茅廬),6（六六大順）,8（發發發）,9（九九歸一），很遺憾這些數和實驗室都關係不太大。符合統計學計算的最常用的兩個數字是5和20,5通常是能進行統計學分析的最少重複次數，20通常用於計算95%的置信區間。大家根據自己的需要選擇合適的重複次數。

三.常見輔料的質檢

輔料的質檢應結合實際工作中可能用到的場景，並非越苛刻越好，需要每個實驗室結合自身情況來設計和調整文中提到的參數。

1.離心管

（1）滲漏密閉性：將n個離心管加入半量墨汁，蓋好蓋子後放入水中，浸泡30min，沒有墨汁滲出爲合格。

（2）離心密閉性：將n個離心管加入半量純水，放入離心機，10000 rpm，30min，管蓋未崩開未漏液爲合格。

（3）熱密閉性：將n個離心管加入半量純水，蓋好蓋子稱重後放入金屬浴中，65℃或90℃（巴氏消毒），30min，再進行稱重，離心管未變形，管蓋未崩開未漏液，前後重量未變化爲合格。。

（4）冷密閉性：將n個離心管加入半量純水，放入-20℃冰箱，24h，離心管未變形，管蓋未崩開未漏液爲合格。

（5）污染物質檢：將n個離心管分別加入半量陰性純水，蓋好蓋子渦旋1 min後靜置5min，吸取純水作爲模板進行擴增，qPCR無擴增爲合格。

（6）抑制物質檢：將n個離心管分別加入弱陽性質控物,室溫靜置5min，然後進行提取;RNA核酸，DNA核酸，室溫靜置5min，作爲模板進行擴增，qPCR擴增未被抑制爲合格。

2.PCR管

（1）滲漏密閉性：將n個PCR管加入半量墨汁，蓋好蓋子後放入水中，浸泡30min，沒有墨汁滲出爲合格。

（2）離心密閉性：將n個PCR管加入半量純水，放入離心機，1000 rpm，30min，管蓋未崩開未漏液爲合格。

（3）熱密閉性：將n個PCR管加入半量純水，蓋好蓋子稱重後放入PCR儀，設置一個常用的PCR程序，程序運行完畢後，再進行稱重，PCR管未變形，管蓋未崩開未漏液，前後重量未變化爲合格。。

（4）冷密閉性：將n個PCR管加入半量純水，放入-20℃冰箱，24h，離心管未變形，管蓋未崩開未漏液爲合格。

（5）污染物質檢：將n個PCR管加入半量陰性純水，蓋好蓋子渦旋1 min後靜置5min，作爲模板進行擴增，qPCR無擴增爲合格。

（6）抑制物質檢：將n個PCR管分別加入弱陽性質控物,室溫靜置5min，然後進行提取;RNA核酸，DNA核酸，室溫靜置5min，作爲模板進行擴增，qPCR擴增未被抑制爲合格。

（7）空白熒光通透性：對於qPCR,需要考察PCR管是否有非特異性熒光信號，將n個空PCR管，蓋好蓋子後放入PCR儀，設置一個常用的PCR程序，程序運行完畢後，qPCR無擴增爲合格。

（8）陽性熒光通透性：對於qPCR,還需要考察PCR管是否會抑制熒光的通透性，將n個含弱陽性樣品和擴增試劑的PCR管，與確認無熒光干擾的PCR管，蓋好蓋子後放入PCR儀一同擴增，設置一個常用的PCR程序，程序運行完畢後，qPCR擴增未被抑制爲合格。

3.濾芯吸頭

測試吸頭需使用經校準的移液器

（1）準確性：將n個吸頭分別吸取定量的純水稱重，重量與體積的關係按照1 g/mL換算。

（2）氣密性：取n個吸頭，吸取最大量程的含有1％甘油的墨水，觀察有色液體不出現在濾塞之上，液麪相同爲合格。

（3）防氣溶膠性能：取n個吸頭，吸取陽性核酸，反覆吹吸10次，換另一個新吸頭在陰性純水中反覆吹吸10次，取陰性純水作爲模板進行擴增，qPCR無擴增爲合格。

（4）污染物質檢：取n個吸頭，吸取陰性純水反覆吹吸10次，取陰性純水作爲模板進行擴增，qPCR無擴增爲合格。

（5）抑制物質檢：取n個吸頭，吸取弱陽性質控物反覆吹吸10次，然後進行提取;吸取RNA核酸和DNA核酸反覆吹吸10次，作爲模板進行擴增，qPCR擴增未被抑制爲合格。

4.採血管、採樣管、採樣拭子和一次性吸管等

主要考察污染物和抑制物

（1）污染物質檢：將n個耗材加入一定量陰性純水，蓋好蓋子渦旋1 min後靜置30min，吸取純水作爲模板進行擴增，qPCR無擴增爲合格。

（2）抑制物質檢：將n個耗材分別加入弱陽性質控物,室溫靜置30min，然後吸取質控物進行提取;作爲模板進行擴增，qPCR擴增未被抑制爲合格。

5.無核酸酶水、PBS等緩衝液

（1）PH值：測量各緩衝液的PH值。

（2）污染物質檢：吸取緩衝液作爲模板進行擴增，qPCR無擴增爲合格。

（3）抑制物質檢：將緩衝液分別與RNA核酸和DNA核酸混合，然後吸取混合液作爲模板進行擴增，qPCR擴增未被抑制爲合格。

6.移液器和離心管架及離心機的內外表面

這些常見物品的外表面容易被核酸和細菌污染，主要查看這兩個指標。

（1）表面核酸污染：用沾溼的拭子擦拭上述物品的外表面，然後浸泡到純水中10min，吸取純水作爲模板進行擴增，qPCR無擴增爲合格。

（2）移液器內腔核酸污染：對於常用的移液器的內部，可使用無濾芯的吸頭在陰性純水中吹吸10次後，吸取純水作爲模板進行擴增，qPCR無擴增爲合格。

（3）表明細菌污染：用沾溼的無菌拭子擦拭上述物品的外表面，劃瓊脂平板，每個平板的菌落數不應超過一定數量（我也不確定多少合適，由於不要求無菌操作一定會有細菌，但是也不應該太多）。

非瘟和新冠後全國一下子新增了很多核酸檢測實驗室，早期大家關注的點都在設施和硬件上，但是一個檢測實驗室開展大量檢測工作之後，檢測中最弱的環節決定檢測的質量。我們也需要將精力放在檢測中的每個細節上。

本文來源：原博士帶你做檢測