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【Science子刊】液體活檢技術的飛躍：約翰霍普金斯大學的DNA甲基化異質性數字分析

【導讀】癌症組織中的分子改變表現出細胞間遺傳和表觀遺傳異質性，使診斷測定的性能複雜化，尤其是在早期癌症檢測方面。傳統的液體活檢方法靈敏度和評估罕見外顯子變異表觀遺傳異質性的能力有限，成本效益不高。團隊報告了一種名爲REM-DREAMing（Ratiometric-Encoded Multiplex Discrimination of Rare EpiAlleles by Melt）的方法，實現了低成本、並行化的逐分子異質甲基化模式分析，用於檢測液體活檢中的癌症。

2024年11月22日，美國約翰霍普金斯大學生物工程系Wang Tza-Huei教授團隊在期刊《Science Advances》上發表了題爲“Multiplex digital profiling of DNA methylation heterogeneity for sensitive and cost-effective cancer detection in low-volume liquid biopsies”的研究論文。在這項研究中，團隊應用該平臺同時評估了5個甲基化生物標誌物的分子間表觀遺傳異質性，以改進基於血液的早期非小細胞肺癌篩查。在一組48例肺部結節不確定患者的低容量液體活檢標本中，團隊發現對分子間甲基化密度分佈的評估，能顯著提高多基因甲基化生物標誌物面板在癌症早期篩查中的性能。

https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.adp1704

關於DNA甲基化

DNA甲基化已成爲檢測早期癌症的極具吸引力的生物標誌物。然而，由於甲基化模式本身會在整個基因組中逐漸演變，從而導致細胞間甲基化的高度異質性，因此，在早期階段對DNA甲基化的評估可能會變得複雜。這些過程發生在癌症組織，其次是健康組織（如細胞週期或與年齡相關的表觀遺傳漂移），會降低診斷測定的臨牀靈敏度和特異性，尤其會削弱DNA甲基化生物標誌物在早期癌症篩查中的效用。

在這項研究中，團隊提出了一種名爲REM-DREAMing（Ratiometric-Encoded Multiplex Discrimination of Rare EpiAlleles by Melt）的方法，它提供了一種簡單而經濟有效的方法，可在單拷貝分辨率下對分子間的外顯子異質性進行高靈敏度的多重分析。研究結果表明，通過評估多基因組的分子間甲基化密度分佈，可以顯著提高傳統甲基化評估技術的性能，臨牀靈敏度達到93%，臨牀特異性達到90%，接收器操作特徵曲線 (ROC) 下的總面積 (AUC) 爲0.96。

REM-DREAMing臨牀驗證

團隊開發了一種五重REM-DREAMing液體活檢測定，以DNA甲基化生物標誌物的五基因面板爲目標，該面板以前曾在NSCLC篩查中顯示出良好的前景。在一項病例對照研究中，通過對低劑量CT掃描篩查出肺部結節的高危患者隊列中的液體活檢組織進行單倍實時甲基化特異性PCR（MethyLight）檢測，臨牀驗證了由5個基因（CDO1、TAC1、HOXA7、HOXA9和SOX17）組成的生物標誌物面板。這項研究的結果證實，與無疾病或良性疾病患者的樣本相比，NSCLC患者的cfDNA中更頻繁地檢測到這些位點的高甲基化。

五重REM-DREAMING驗證

血漿中甲基化生物標誌物的多重檢測

多元模型的結果大大優於任何單個標記物，臨牀靈敏度達到93%，臨牀特異性達到90%，總體AUC爲0.96。能優化CDO1、TAC1、HOXA7和SOX17面板AUC的甲基化密度臨界值，與之前發現的各標誌物的臨界值相同。但是，HOXA9組合的最佳甲基化密度閾值現在從重度甲基化（90%）轉變爲中度甲基化（50%）。對於該試驗隊列，五重REM-DREAMing平臺的診斷性能大大優於之前公佈的基於單重MSP和多重數字MSP（mdMSP）的診斷性能。

單個生物標誌物的診斷性能。

總結

1. REM-DREAMing的技術優勢：REM-DREAMing平臺的關鍵優勢是產生的豐富數據，可全面評估給定面板中感興趣的生物標誌物或基因座的表位分佈，提高臨牀靈敏度。

2. 甲基化密度的評估：在單個DNA分子水平上評估甲基化密度有助於建立有效的閾值，克服各種背景來源的噪音。

3. 樣本量減少：REM-DREAMing能以較小的樣本量（如1毫升）獲得多種生物標記物的富集數據集，而許多基於NGS的技術每次檢測需要5毫升或更多。

4. 改進的數字化方法的臨牀實用性：REM-DREAMing檢測法可以大幅減少不必要的侵入性和潛在危險的隨訪程序，改善CT掃描陽性患者的預後，降低醫療費用。

5. REM-DREAMing的侷限性和未來改進：目前的平臺存在侷限性，需要改進以更好地應用於臨牀，如提高納米孔密度或將更多模塊集成到擴展設備中。

6. REM-DREAMing的診斷潛力：REM-DREAMing提供了一種簡單、低成本的方法，通過同時評估單拷貝靈敏度下的外顯子甲基化模式，全面剖析甲基化生物標誌物擴展面板中的分子間甲基化異質性，有望成爲早期癌症的常規篩查工具。

參考資料：

1.A. L. Mattei, N. Bailly, A. Meissner, DNA methylation: A historical perspective. Trends Genet. 38, 676–707 (2022).

2.S. B. Baylin, J. G. Herman, DNA hypermethylation in tumorigenesis: Epigenetics joins genetics. Trends Genet. 16, 168–174 (2000).

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