科學家發現極小型Cas13j蛋白，擁有100%國內自主知識產權

“非常期待這款工具能得到深入應用，目前已經有好幾個實驗室找我們要這個工具。”湘湖實驗室李果研究員表示。

圖 | 李果（來源：李果）

日前，他和合作者發現了極小型 Cas13j 蛋白，並實現了高效的體內 RNA 編輯。

無論是對於生物多樣性的展現，還是對於新型 RNA 工具的開發與應用，本次成果都具有重要意義。

在遺傳疾病治療上，在合成生物學的細胞工廠調控上，乃至於在農業生物技術上，這種新型 Cas13j 技術都具有重要的應用價值。

李果表示，新型 Cas13j 最大的特點便是小型化。目前，在自然狀態之下最小的 ChiCas13j 包含 424 個氨基酸。

通過截短處理之後，可以將氨基酸進一步縮小到 340 個，這也意味着它是目前公開報道中最小的 Cas13 蛋白。

基於這一蛋白所構建的 RNA 鹼基編輯器，不僅僅體型非常小，而且效率非常高。

本次研究中，課題組已將其成功用於小鼠個體內的 C>U 單鹼基編輯，爲 RNA 編輯的治療提供了新工具。

無論是基於 CRISPR-Cas13 系統的抗病毒研究，還是基於 RNA 單鹼基編輯器的疾病位點修復治療，Cas13j 都展現出不錯的優勢。

對於李果來說，這可能不僅僅是一篇論文的發表，也是他過去六年的心血之作。

（來源：Nature Chemical Biology）‌

從微生物序列信息中“挖寶”

2018 年，李果開始在中國農業大學讀博，師從於該校的胡曉湘教授。該團隊的研究方向之一是基於基因編輯技術的大動物模型製備。

她安排第一個課題是讓李果去開發高效的多基因編輯工具，以用於動物模型的快速製備。

2018 年底，李果被導師安排到上海科技大學黃行許教授團隊學習基因編輯技術，自此開始了將近三年的聯合培養。

黃行許課題組的研究領域非常豐富，課題方向涵蓋 DNA 編輯、RNA 編輯、表觀遺傳修飾、基因編輯治療、CAR-T（Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy，嵌合抗原受體 T）細胞治療等。

來到上海科技大學快一個月的時候，李果做了一次關於 RNA 病毒的組內 Journal Club。

通過大家的交流討論，他了解到 RNA 病毒給人類帶來的危害，也瞭解到在“中心法則”這個承上啓下的重要階段裡 RNA 的世界是多麼的豐富。

“隨即，我就和黃老師確定要做 RNA 編輯工具開發與應用的課題方向。”李果表示。

和 DNA 不同的是，RNA 更加豐富多變，同時在疾病治療上基於 RNA 編輯的治療也更加安全，脫靶風險相對較小。

因此，李果非常看好 RNA 編輯治療的應用前景。隨後，他和合作者也發了幾篇關於 RNA 編輯工具優化改造與應用的論文。

同時，針對 RESCUE（RNA Editing for Specific C to U Exchange）RNA 鹼基編輯系統，李果等人還針對脫靶風險加以評估，分別從脫靶 SNVs 與 mRNA、miRNA、lncRNA 與 circRNA 的表達關聯、以及 ceRNA 網絡變化進行了系統性總結。

基於 RESCUE 的特性，李果和同事相繼開發了編輯效率更高的 eRESCUE、以及開發了脫靶率更低的 ecRESCUE 編輯器。

同時，他們與復旦大學附屬醫院耳鼻喉科舒易來教授團隊合作，構建了單點突變顯性致病耳聾模型鼠的 RNA 編輯治療新方法，從而將 CRISPR-CasRx 系統成功用於貝多芬鼠的耳聾治療研究。

基於這些成果，他們想試試能否挖掘出新型 Cas13 蛋白。

（來源：Nature Chemical Biology）

目前，國內已經報道的基於 CRISPR-Cas13 系統的 RNA 編輯工具，仍然面臨着三大挑戰：

首先，不夠小型化。現有的 Cas13 的 RNA 編輯器由於分子尺寸過大，導致遞送效率低。

其次，效率不夠高。基於 Cas13 的 RNA 編輯技術的高效性和精準性依然欠佳。

再次，不夠新穎。當下國內依舊十分缺乏具有自主知識產權的新型 Cas13 蛋白。

爲了助力於解決上述問題，李果等人希望通過 BT（Biotechnology）-IT（Internet Technology）融合技術，建立新型 Cas13 蛋白的智能挖掘算法。

通過對微生物大規模宏基因組數據開展計算分析，來挖掘微小型的 Cas13 蛋白。

目的就是希望能夠開發 1-2 種具有中國自主知識產權的微小型 RNA 高效基因編輯底層技術，並至少構建一種基於微小型 RNA 編輯工具的遺傳性疾病治療方案。

儘管此前領域內也有多個基於新型 Cas 蛋白的“挖掘類成果”，但是它們所使用的數據來源於美國國家生物技術信息中心的公衆數據庫。

這些已被公佈的數據量相對比較有限，同時也已被充分挖掘過。

這時，李果等人注意到浙江大學科創中心的馬斌教授團隊，瞭解到後者主要從事土壤微生物種質資源分析的工作。

多年來，馬斌課題組針對土壤微生物基因組，開展了一系列的測序、組裝和註釋工作，構建了基於土壤微生物的宏基因組數據庫。

李果等人和馬斌團隊溝通之後，後者表示對於新型 CRISPR 系統的挖掘工作也非常感興趣。於是，雙方聯合開展了針對微小型 CRISPR-Cas13 系統的挖掘工作。

分析之後發現，在大量的土壤微生物宏基因組數據庫中，他們所關注的只是冰山一角，還有更多有意思的成分包括其他的抗菌肽、塑料降解酶、CRISPR-Cas 系統和互作功能因子等。

這些新的功能蛋白，不僅能用於開發新型工具，同時還能用於研發新的轉化產品。

這進一步堅定了李果等人所要專注方向：即從微生物的序列信息裡尋找新東西。

（來源：Nature Chemical Biology）

一篇論文，兩項專利

爲了解決遞送上的瓶頸問題，他們將研究重點聚焦於微小型 Cas13 蛋白的發現上。

期間，李果等人和合作者經過多次溝通之後，最終選擇了馬斌團隊組裝好的一個土壤微生物宏基因組數據庫。

然後，在這些序列之中，他們針對已知 Cas 蛋白加以檢索，藉此證實了數據庫的有效性、以及分析方法的通用性。

接着，李果等人開始挖掘數據以及開展實驗。對於 Cas13 蛋白的智能挖掘來說，主要分爲以下三步：

第一步，重建土壤微生物宏基因組序列庫。

第二步，針對 Cas13 蛋白進行智能挖掘。

第三步，獲取 Cas13 蛋白 crRNA DR 序列。

隨後，課題組基於 CIRSPR-Cas13 系統的特徵，從目標 Cas13 蛋白基因座中確定了 crRNA DR 序列。

並使用 CRISPRTarget 軟件針對 DR 序列進行 RNA 二級結構分析，以便讓 sgRNA 能夠表達載體構建。

圖 | 宏基因組數據計算輔助小型 Cas13 蛋白智能挖掘流程圖（來源

在實驗部分，李果和合作者先是針對微小型 Cas13 蛋白開展進化分析與功能驗證。

然後，開發了微小型 RNA 鹼基編輯器，接着研究了體內靶向 PCSK9 mRNA 編輯降低低密度脂蛋白（LDL，Low density lipoprotein cholesterol）表達的應用。

在撰寫論文的同時，李果等人還將論文的主體部分分成“一種 VI-J 型 CRISPR-Cas13 基因編輯系統及其應用”與“一種超小型 RNA 鹼基編輯器及其應用”兩個板塊進行了專利申請。

李果表示：“記得研究剛開始的時候，我們團隊的程亞仙博士（論文並列第一作者）對我算是極度的不信任，曾經因爲一個質粒信息的偏差，一大早就對睡眼惺忪的我瘋狂輸出了一頓，哈哈。”

但是，在接下來的日子裡他們彼此真誠相待。“我們可以做實驗做到很晚，也可以起得很早，也可以沒有周末，會因爲一個流式結果開心一下午。”李果說。

最終，他們一起攜手完成兩個項目，期間他們選擇相信彼此，在成爲好朋友的同時，也成爲了最好的實驗搭檔。

而在 2024 年“五一”假期的前一週，他們剛把修改後的論文提交上去。

“可能整個‘五一’節大家都是在忐忑中度過的。當收到論文被接受的郵件的那一刻，腎上腺素快速分泌的感覺至今難忘，大家都非常開心與激動。”李果表示。

圖 | 團隊照片（來源：課題組）

最終，相關論文以《使用天然微型 Cas13j 核酸酶的緊湊型 RNA 編輯器》（Compact RNA editors with natural miniature Cas13j nucleases）爲題發在Nature Chemical Biology（IF 12.9）。

李果是共同一作兼共同通訊，浙江大學程亞仙博士是共同一作，浙江大學的姚遠教授、馬斌研究員和陳學新教授擔任共同通訊作者 [1]。

圖 | 相關論文（來源：Nature Chemical Biology）

如前所述，在本次研究之中該團隊針對新型 Cas13j 蛋白做了各種優化與 RNA 編輯器改造，同時也將其成功用於體內 RNA 編輯治療。

儘管 CRISPR-Cas13j 在 RNA 的精確編輯上展現出一定優勢，但是依舊停留在實驗室水平。

因此：

一方面，李果等人將基於 Cas13j 蛋白進一步地優化工具，並打算解析 Cas13j 的蛋白結構，以便更加細緻地闡明它的工作機制，從而能夠更好地用於後期的優化改造。

另一方面，李果等人也正在探索將 CRISPR-Cas13j 用於農業動物的疫苗研發、抗 RNA 病毒育種、結合疾病位點的臨牀治療等。

“這就需要更多人來使用和驗證我們的工具，因此期待更多學者可以和我們一起合作，充分發揮 Cas13j 蛋白的優勢。”李果說。

他繼續說道：“近年來，AI 技術正在變革生命科學的研究範式，其實我們團隊很早就關注了 AI 技術的發展。”

之前，他們曾嘗試使用神經網絡對抗學習（Protein-GAN）系統去研發新型 RNA 編輯工具，希望能夠將 APOBEC 脫氨酶與 TadA 進行賦能，從而構建多功能的新型 RNA 編輯器。

同時，他們也嘗試過基於 Protein-GAN，來以人工方式生成新的 Cas 蛋白。

“雖然這些論文我們都沒有發表，但這些嘗試讓我們更加堅定要做好 IT 和 BT 的融合。”

事實證明，ChatGPT 大數據模型的出現，讓他們將上述兩種嘗試變成了現實。

而基於 AI 技術的發展，他們目前正在開展 Structure-guided/Sequence-guided 的融合挖掘，並正在基於 Structure-guided 開展蛋白進化分析、A + B= AB 的蛋白賦能等工作。

參考資料：

1.Li, G., Cheng, Y., Yu, J.et al. Compact RNA editors with natural miniature Cas13j nucleases.Nat Chem Biol(2024). https://doi.org/10.1038/s41589-024-01729-8

排版：羅以、劉雅