國自然熱點：可變剪切該如何研究

來源：青椒醫學

一、可變剪切是什麼？

可變剪切（Differential splicing），也叫選擇性剪切（Alternative splicing），是真核生物基因表達調控中的一個重要環節，涉及到預 mRNA（前體信使 RNA）的加工過程。這一過程使得單一的基因能夠產生多種蛋白質，極大地增加了蛋白質的多樣性和細胞功能的複雜性。

以下是對可變剪切的概念、原理和機制的詳細介紹：

概念

可變剪切是指在前體 mRNA 轉錄後的加工過程中，不同的剪切選擇導致了不同的外顯子（即編碼蛋白質的基因片段）被包括或排除，形成多種成熟 mRNA 剪切異構體。這些不同的 mRNA 異構體最終被翻譯成結構和功能不同的蛋白質。

原理

在基因轉錄過程中，基因的 DNA 序列被轉錄成前體 mRNA。前體 mRNA 包含編碼序列（外顯子）和非編碼序列（內含子）。在成熟 mRNA 形成之前，內含子需要從前體 mRNA 中移除，而外顯子則連接在一起。可變剪切涉及到在這個剪切過程中作出選擇性的決策，即決定哪些外顯子被保留或剔除。

機制

剪切體系: 剪切是由剪切體（spliceosome）完成的，剪切體是由多個小核糖核蛋白（snRNP）和其他蛋白質組成的複雜機器。這些組分協同作用，識別前體 mRNA 上的特定序列，執行剪切反應。

調控因子: 可變剪切的特異性由多種調控蛋白（如剪切增強子和剪切抑制子）控制，這些蛋白能夠識別特定的序列並促進或抑制剪切的發生。

選擇性剪切: 根據細胞類型、發展階段或環境條件，剪切可以是選擇性的，使得同一基因在不同情境下可以產生不同的蛋白質。

應用

可變剪切在許多生物學過程中扮演着關鍵角色，包括細胞分化、器官發育和疾病發生。對其機制的研究不僅有助於理解基因表達的複雜性，還可能對疾病治療，特別是遺傳性疾病和癌症的治療提供新的策略。

這一領域的研究在不斷進展，隨着高通量測序和生物信息學技術的發展，科學家們能更深入地探索不同條件下的可變剪切模式，爲疾病診斷和治療提供更精確的生物標記和治療靶點。

二、研究方法

可變剪切的研究涉及多種技術手段和檢測指標，以解析其複雜的生化途徑和調控機制。以下是一些關鍵的研究方法和技術：

1. RNA 測序 (RNA-seq)

RNA 測序是一種高通量的技術，可以在單次實驗中從整個轉錄組中獲取大量的讀段。通過對這些讀段進行比對和重建，研究者可以識別出大量的可變剪切事件，包括那些以前未被發現的新剪切形式。RNA-seq 數據可以用來分析可變剪切模式的變化，比如在不同組織、發育階段或疾病狀態下的差異。

2. 外顯子芯片 (Exon Arrays)

外顯子芯片是一種基於芯片的方法，設計有覆蓋基因外顯子的探針。通過分析芯片上的雜交信號，可以定量地檢測特定外顯子的包含與否，進而推斷可能的剪切模式。儘管它的分辨率不如 RNA-seq，但外顯子芯片仍然是分析特定條件下可變剪切事件的一個有用工具。

3. 核糖體剖面 (Ribosome Profiling)

核糖體剖面是一種先進的技術，通過測定核糖體保護的 mRNA 片段來確定哪些 mRNA 正在被翻譯。這種方法可以用來檢測因可變剪切而產生的不同蛋白質產物，從而更好地理解可變剪切在蛋白質層面的功能影響。

4. 生物信息學分析

隨着高通量測序技術的普及，生物信息學在可變剪切分析中扮演着越來越重要的角色。使用專門的算法和軟件（如 TopHat, SpliceSeq 等）可以從複雜的數據集中鑑定和量化剪切事件，同時預測剪切調控元件。

三、結果分析

下面我們來舉 2 個例子帶大家一鍵看懂可變剪切實驗結果。

1. Minigene 實驗顯示 SRRM2 敲低改變 FES 和 SH3BP2 兩個基因剪接模式（PMID：35929045，Nucleic Acids Research，中科院一區，IF：14.9）

這幅圖顯示了 SRRM2 敲除對 FES 和 SH3BP2 兩個基因剪接模式的影響。實驗使用了轉染了對照（SCR）和 SRRM2 敲除（sh1、sh2）的 HEK293T 細胞，並通過 RT-PCR 來可視化微小基因的剪接模式。

如何分析這些凝膠圖像：

a.識別條帶：

每個凝膠圖像顯示了幾個條帶，這些條帶代表不同的剪接變體。這些條帶的強度和存在與樣品間有所不同，表明剪接效率的差異以及形成的剪接變體類型的差異。

b.比較對照組和敲除樣本：

FES 基因：

在對照組（SCR）中，可以看到兩個明顯的條帶，表明有兩個主要的剪接變體。在 SRRM2 敲除組（sh1、sh2）中，這兩個條帶的一個或兩個強度有所減弱，這表明 SRRM2 的敲除影響了這些剪接變體的形成。

SH3BP2 基因：

對照組（SCR）同樣展示了兩個主要條帶。SRRM2 敲除樣本中這兩個條帶的模式改變了，特別是在 sh2 樣本中，某些條帶的強度明顯改變，這可能表明剪接機制的顯著變化。

2. CLIP-seq 顯示 YBX1 導致多基因外顯子跳躍的錯誤剪切。（PMID：36943004，Embo J，中科院一區，IF：11.4）

這張圖展示了 CLIP-seq（Cross-linking and immunoprecipitation followed by sequencing）數據，用以分析 YBX1 蛋白與多個基因的 RNA 相互作用，以及這些相互作用如何影響外顯子的剪切，特別是外顯子跳躍（exon skipping）。

每個基因（Fn1-SE, Nrp2-SE, Sp7-SE, Sirt2-SE, 和 Spp1-SE）都有相應的圖表：

藍色條代表基因的編碼區域，即外顯子。

紅色峰值表示 YBX1 蛋白在 RNA 上的結合位點，其強度反映了結合的密集程度。

分析方法：

識別重要區域：每張圖中虛線區域表示外顯子跳躍的位置

a.理解結合模式的影響：

通過比較有無 YBX1 結合的區域，可以推斷 YBX1 結合的存在與否如何影響相鄰外顯子的包含或排除。例如，如果某個結合峰位於兩個外顯子之間的內含子上，YBX1 的存在可能促使這一區域的 RNA 不被剪切，從而導致外顯子跳躍。

b.對比不同基因的響應：

觀察不同基因如 Fn1 和 Spp1 在 YBX1 結合後剪接模式的變化。Spp1 的 CLIP 信號異常高，可能表明 YBX1 對該基因的剪接調控作用非常顯著。

四、國自然中標統計

2023 年醫學科學部「可變剪切」中標項目熱度逐漸攀升

部分中標項目

總而言之， 可變剪切作爲一個在基因表達調控中極爲關鍵的過程，其研究不僅增進了我們對生物多樣性和細胞功能複雜性的理解，還爲疾病診斷和治療提供了新的視角和方法。通過不斷髮展的技術如 RNA-seq 和 CLIP-seq，科學家們能夠更深入地探索可變剪切的機制和功能，發現新的生物標記和治療靶點。隨着高通量技術的進步和生物信息學的應用，可變剪切的研究正在迎來新的發展階段，有望在未來在精準醫療和個性化治療中發揮更大的作用。

2024 年度國自然醫學部 50 大科研熱點中標數統計如下：